Surexpression et etude des parametres responsables de la liaison de proteines acylees des photorecepteurs aux membranes et optimisation de la myristoylation de la recoverine chez Escherichia coli (French and English text)

La recoverine est une proteine peripherique presente dans les batonnets de la retine des vertebres et qui possede la propriete de lier l'ion calcium (Ca 2+). Un acide gras myristoyl (14:0) est lie de facon covalente a une glycine de l'extremite N-terminal de la recoverine. Cette proteine agit dans la regulation de la reponse cellulaire des batonnets suite au changement de la concentration en Ca2+ intracellulaire. En effet, la liaison de deux atomes de Ca2+ par la recoverine provoque l'extrusion de son myristoyl, ce qui augmente son affinite pour la membrane cellulaire et mene a l'inhibition de la rhodopsine kinase. Cependant, en absence de Ca 2+, le myristoyl est enfoui a l'interieur de la recoverine, ce qui diminue son affinite pour les membranes et provoque l'activation de la rhodopsine kinase qui phosphorylera ensuite la rhodopsine. Toutefois, la liaison de la recoverine aux membranes est complexe et plusieurs parametres peuvent influencer cette liaison. Par consequent, dans cette these, nous voulions determiner les parametres responsables de la liaison de la recoverine aux membranes en etudiant, notamment, le role de la myristoylation, des acides amines hydrophobes et charges positivement ainsi que de la force ionique.; Dans un premier temps, nous avons ameliore une methode de surexpression de la recoverine recombinante myristoylee et non myristoylee dans les bacteries E. coli en utilisant un substrat soluble, le myristate de sodium, et une resine de phenyl-sepharose de faible substitution. Ceci a permis d'obtenir la recoverine myristoylee et non myristoylee en une seule etape de purification en plus d'augmenter la quantite de recoverine myristoylee purifiee. De plus, nous avons utilise la spectroscopie de force afin de quantifier la force de liaison de la recoverine a une bicouche de phospholipides en presence et en absence de Ca2+. Ces travaux ont montre que la myristoylation est le parametre majeur permettant la liaison de la recoverine aux membranes. Par ailleurs, nous avons mesure l'adsorption de la recoverine myristoylee et non myristoylee a des monocouches de phospholipides de dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) a l'interface air/eau par des mesures de pression de surface et de spectroscopie infrarouge par modulation de polarisation (PM-IRRAS). (Abstract shortened by UMI.)...