Identification des determinants moleculaires composant la pochette de liaison de GPCRs a ligands peptidiques par marquage par photoaffinite et par la methode 'SCAM' (French and English text)

Afin d'identifier les residus formant la pochette de liaison du recepteur AT1 de l'angiotensine II (AngII), nous avons tout d'abord utilise la methode de marquage par photoaffinite. Pour ce faire, nous avons developpe des analogues photosensibles de l'AngII soit le [Bpa1]AngII, le [Bpa3]AngII et le [Bpa8]AngII. A l'aide des analogues radiomarques avec de l'iode 125, nous avons photomarque specifiquement le recepteur AT1 exprime dans des cellules COS-7. Afin de circonscrire le site de contact pour chacun des analogues, nous avons soumis les complexes ligand-recepteur a des digestions chimiques et enzymatiques. L'analyse des fragments obtenus nous a permis de determiner que le site de contact des analogues 125I-[Bpa1]AngII et 125I-[Sar1,Bpa3]AngII se trouve essentiellement dans la 2e boucle extracellulaire du recepteur alors que le 125I-[Sar1,Bpa8]AngII fait contact avec le 7e domaine transmembranaire (TM7). Ensuite, nous avons utilise la methode de marquage par photoaffinite dans le contexte du recepteur de l'urotensine II (UII), le GPR14. Ainsi l'analogue de l'UII, le 125I-[Bpa6]UII a permis de photomarquer specifiquement le GPR14. L'analyse du patron des digestions chimiques et enzymatiques du GPR14 photomarque, nous a permis de determiner que le site de contact de cet analogue se trouve dans le TM4 du GPR14. Dans un deuxieme temps, afin de determiner l'orientation du TM7 du recepteur AT1 dans la pochette de liaison, nous avons utilise la methode de SCAM (Substituted-Cysteine Accessibility Method). Les residus Ile276 a Tyr302 du recepteur AT1 ont ete substitues par des cysteines (Cys) par mutagenese dirigee. Les recepteurs mutants ont ete traites avec le MTSEA, un reactif modifiant les Cys exposees a un milieu aqueux. Ainsi, une modification des Cys exposees a la pochette de liaison va alterer la liaison du ligand au recepteur. Le traitement du recepteur AT1 natif avec le MTSEA n'a pas affecte la liaison de l'antagoniste peptidique 125I-[Sar 1-Ile8]AngII, ce qui suggere que les Cys endogenes ne sont pas exposees a la pochette de liaison. Le MTSEA a altere la liaison de l'antagoniste aux recepteurs A277C, V280C, T282C, A283C, 1286C, A291C et F301C ce qui supporte la localisation de ces residus dans la pochette de liaison. (Abstract shortened by UMI.)...