Caracterisation moleculaire et biochimique du mecanisme de polyglutamylation des folates chez le parasite Leishmania et role de la polyglutamylation dans la resistance des leishmanies aux antifolates (French text)

Nous avons clone le gene codant pour la folylpolyglutamate synthetase (FPGS) chez Leishmania tarentolae. Ce gene code pour une proteine de 538 acides amines demontrant plus de 30% d'identite avec la FPGS de d'autres organismes. Nous avons montre que les folylpentaglutamates sont majoritaires chez L. tarentolae et L. donovani infantum promastigotes et amastigotes. Nous avons montre que le nombre de copies de FPGS influence la longueur de la chaine glutamique ajoutee aux folates. De plus l'augmentation de l'expression de FPGS augmenterait l'accumulation des folates.; Nous avons egalement montre que les MTX-triglutamates et les MTX-monoglutamates sont respectivement majoritaires chez L. tarentolae et L. major. La FPGS est active envers le MTX chez L. major par contre cette espece a une activite MTX alpha-hydrolase que L. tarentolae ne semble pas avoir. Ceci pourrait expliquer la difference dans la polyglutamylation. Par transfection ou inactivation partielle du gene FPGS nous avons montre que son niveau d'expression influence la longueur de la chaine glutamique ajoutee au MTX, la retention de la drogue, et joue un role decisif dans la susceptibilite du parasite au MTX. Ce role est strictement dependant de la concentration des folates dans le milieu environnant. L'analyse des mutants resistants au MTX dont l'entree du MTX est alteree, a montre que la presence des MTX a tres courte chaine glutamique est correlee a la resistance a la drogue.; Nous avons genere un mutant L. tarentolae dont les deux genes codant pour le transporteur et la reductase de la biopterine sont inactifs. Ces cellules deploient des mutations compensatoires et leur activite FPGS etait augmentee et consequemment les folates et le MTX etaient retrouves avec des chaines polyglutamiques plus longues. Ce mutant etait hypersensible au MTX mais nous avons reussi a generer deux mutants hautement resistants au MTX. L'analyse de ces derniers a revele la co-existence de plusieurs mutations associees a la resistance au MTX. Celles-ci incluaient une forte diminution de l'entree des folates/MTX, une amplification du gene codant pour la dihydrofolate reductase, la cible du MTX, et une quasi-absence des MTX-polyglutamates qui ne semble pas etre liee a une modulation de l'activite FPGS.